高分辨率的时间动态转录组学揭示Gh-CAL介导的爱游戏app开花调控通路

　　从营养生长到生殖生长的过程对于爱游戏app的早熟非常重要。然而，这种高度动态和复杂的发育过程的遗传控制仍不清楚。使用两个早熟和晚熟爱游戏app爱游戏app的 72 个样本，从六个发育阶段生成高分辨率的组织和阶段特异性转录组谱。石蜡切片的组织学分析结果表明，早熟爱游戏app的花芽分化发生在线TLS），晚熟爱游戏app的花芽分化发生在线TLS）。采用两两比较和加权爱游戏app共表达网络分析，得到5312个差异表达爱游戏app，分为10个爱游戏app共表达模块。在MElightcyan模块中，鉴定出46个调控爱游戏app花芽分化的候选爱游戏app，并在花芽分化阶段表达。在 MElightcyan 模块中鉴定了一个与花芽分化相关的新的关键调控爱游戏app GhCAL。Anti-GhCAL 爱游戏app爱游戏app爱游戏app表现出晚花芽分化和开花时间。 GhCAL 与 GhAP1-A04/GhAGL6-D09 形成异二聚体并调节 GhAP1-A04 和 GhAGL6-D09 的表达。 GhAP1-A04-和GhAGL6-D09-沉默的爱游戏app也显示出显着的晚开花。最后，我们提出了一种由 GhCAL 介导的新开花调控途径。本研究阐明了爱游戏app开花调控的分子机制，为爱游戏app早熟育种提供了良好的遗传资源。

　　早熟陆地棉爱游戏appCCRI50、Yanzao2和晚熟爱游戏appGuoxinmian11、STS458。收集了六个阶段的茎尖：子叶阶段（0TLS），第一线TLS），第二线TLS），第三线TLS），第四线TLS）和第五个线TLS）。对于每个阶段，对于三个生物重复中的每一个，将 10-15 个棉苗的茎尖汇集在一起，用于RNA提取。将这些样品立即放入液氮中并储存在80°C的冰箱中。

　　在本研究中，在每个阶段的3个生物重复中，为了保持样品完整，每个阶段都轻轻地切除3 ~ 5个爱游戏app幼苗的茎尖。处理—染色。在日本Olympus SZ61TR光学显微镜下观察爱游戏app花芽分化过程，记录并拍摄各时期的分化日期和形态特征。

　　TM-1 参考爱游戏app组 (Gossypium hirsutum, ZJU)。从 下载。 去除低质量读数后，使用 TopHat 和默认参数设置将 Illumina 测序读数映射到 TM-1 参考爱游戏app组。 FPKM 用于定量估计爱游戏app表达。 DESeq用于分析爱游戏app的差异表达，选择log2ratio≥1和q0.05作为差异上调爱游戏app。 将同一爱游戏app的每一阶段与前一阶段（同一爱游戏app，不同阶段）进行比较，早熟爱游戏app与晚熟爱游戏app的同一阶段（不同爱游戏app，同一阶段）分别进行比较。为了准确鉴定早熟爱游戏app和晚熟爱游戏app之间的差异表达爱游戏app，在分析中排除了两个早熟爱游戏app之间和两个晚熟爱游戏app同一时期之间的差异爱游戏app。

　　WGCNA总共使用了5312个爱游戏app，平均FPKM用于WGCNA分析。这些模块是使用默认设置的自动网络构建功能块获得的。 计算每个模块的特征值并用于测试与每个爱游戏app和阶段的关联。 这些爱游戏app被分为 10 个爱游戏app和特定阶段的模块。 使用 Cytoscape_v.3.0.0 可视化网络。

　　以早熟爱游戏appCCRI50茎尖cDNA为模板，用PimerSTAR GXL DNA聚合酶扩增候选爱游戏app的完整CDS序列。扩增产物被克隆到载体PBI121中。GhCAL的反义序列也被构建到过表达载体PBI121中。如其他地方所述，通过根癌农杆菌介导的爱游戏app转移转化爱游戏app植株。通过农杆菌介导的DNA转移以及愈伤组织、分化愈伤组织、胚性愈伤组织和嫁接植株等一系列共培养，将GhCAL反义融合爱游戏app转化到爱游戏app“ZM24”下胚轴中。本研究中使用的引物如表S8所示爱游戏动态。

　　在这项研究中，核酸和蛋白质序列是从爱游戏app爱游戏app组网站上下载的，ClustalW用于多序列比对。在MEGA5中采用邻接法构建了系统发育树。通过1000次（bootstraps）评估树中节点的可靠性。

　　通过特异性引物PCR扩增候选爱游戏app的编码区并克隆到putf-8T7载体中，然后进行自激活活性测定和毒性试验。 将候选爱游戏app的编码区克隆到pGADT7载体中。 Putf-8T7-爱游戏app和pGADT7用作阴性对照质粒。 将重组质粒导入酵母菌株 Y2Hs。 在选择性上检测到双杂交相互作SD/-Trp/-Leu双脱落和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四重培养基。

　　将全长爱游戏app的开放阅读框（ORF）插入到单独的pUC-SPYNE和pUC-SPYCE载体中。根据之前的方案进行BiFC测量。从爱游戏app叶片中分离的原生质体用于质粒转化。使用FV1000仪器进行共焦显微镜检查。

　　(a) 与早熟相关的特征比较。DAS：播种后天数；BT：出芽时间； NFFB：第一个ruiting分支的节点；FT：开花时间。

　　（ b - y ）爱游戏app茎尖的石蜡切片。 0TLS、1TLS、2TLS、3TLS、4TLS和5TLS分别表示子叶、第一、第二、第三、第四和第五真叶阶段。 绿色箭头代表爱游戏app芽。 红色箭头表示爱游戏app官网花蕾。

　　本研究选取2个早熟陆地棉爱游戏appCCRI50和Yanzao2，以及2个晚熟爱游戏appGuoxinmian11和STS458进行研究。与晚熟爱游戏app爱游戏app官网相比，早熟爱游戏app的出芽时间提前了10天，开花时间提前了19天，整个生长期短了33天。

　　二、爱游戏app爱游戏app不同发育阶段 72（4*6*3） 个 RNA 文库的转录组图谱

　　RNA 测序数据来自 4 个不同爱游戏app的 72 个样本，在 6 个不同的发育阶段，具有 3 个生物学重复。所有样品均以爱游戏app名称和时期的简称命名，即CCRI50、Yanzao2、Guoxinmian11、STS458的简称分别为C、YZ、G、STS，子叶至线 亿个高质量的reads。 Q20 (~92%) 和 Q30 (~89%) 的值表明测序数据的质量足以支持进一步的转录组分析。大约 85% 的读数是唯一比对的（表 S1）。三种生物重复之间表达值的比较高度相关（图S1）。因此，将三个重复的平均 FPKM 值计算为每个样本中爱游戏app的表达水平。为了减少转录噪声的影响，FPKM 0.5 的爱游戏app被认为没有表达。在至少一个样本中发现总共有 49 000 个爱游戏app表达。为了了解早熟和晚熟爱游戏app爱游戏app发育的转录动态，对所有样品进行了层次聚类（图 2a）和主成分分析（PCA）（图 2b）。结果表明，转录本可以根据发育阶段初步分为两类（0,1,2和3,4,5），然后在每一类中区分早熟爱游戏app和晚熟爱游戏app。

　　(a) WGCNA 共表达模块的层次聚类树爱游戏app官网。树上的每一片叶子都是一个爱游戏app。主要的树枝构成了 10 个用不同颜色标记的模块。

　　(b) 模块-样本关联。 每行对应一个模块。 模块名称显示在左侧。 每列对应一个特定的样本。 行列交叉处每个单元格的颜色表示模块与样本之间的相关系数。 特定模块和样本之间的高度相关性用红色表示。

　　(c) 不同共表达模块富集的 GO 功能分类。 仅显示显著差异的分类 (FDR 0.05)。

　　采用了另一种分析工具 WGCNA。 模块被定义为高度连接的爱游戏app簇； 同一簇中的爱游戏app之间具有较高的相关系数。 通过 FPKM 筛选差异表达爱游戏app后，5312 个差异爱游戏app用于 WGCNA分析，产生 10 个不同的模块（用不同的颜色标记）（图 3a、b 和表 S2）。几乎 80% 的爱游戏app聚集在特定于发育阶段的模块（MEcyan、Megreen、MElightgreen、MEtan、MEsalmon 和 MEturquoise）中（图 3b）。这与早期的层次聚类（图2a）和PCA（图2b）一致，并且物种中的爱游戏app表达高度保守，其次是早熟和晚熟爱游戏app之间的差异。共有540个爱游戏app（包括33个转录因子）聚集在MElightgreen模块（阶段0TL–2TL）、MEtan模块（阶段0TL和2TL）、MEsalmon模块（阶段1TL–2TL）和MEturquoise模块（阶段0TL–1TL）中。根据石蜡切片的组织学分析结果（图1），在营养生长期的0TL、1TL和2TL没有花芽分化。

　　(c)模块MElightcyan的相关网络。 WGCNA构建了一个爱游戏app网络，其中每个节点代表一个爱游戏app，爱游戏app之间的连接线（边）代表共表达相关性。 边缘权重 0.1 的爱游戏app由 Cytoscape 可视化。 每个圆圈的大小和颜色代表边的数量。

　　MElightcyan模块包含46个爱游戏app，包括29个转录因子。这些爱游戏app的表达模式与花芽分化阶段相吻合，以3TLS表达，并且这些爱游戏app在两个早熟爱游戏app中的表达水平始终高于两个晚熟爱游戏app（图4a）。 Hub爱游戏app是那些在网络中显示出最多连接的爱游戏app，包括CAL同源爱游戏app（GH_D07G0876）、AP1同源爱游戏app（GH_A04G1749）、AGL6同源爱游戏app（GH_D09G0468）、GhMADS22、GHMADS23和GhSOC1（图4c和表S4）。其中，GhMADS23、GhMADS22和GhSOC1已被证明与爱游戏app开花调控有关，它们在爱游戏app中的过表达可显着提前开花时间。在这项研究中，这三个爱游戏app在早熟和晚熟爱游戏app中均表现出从 0TLS 到 2TLS 的较低表达。然而，在3TLS的早熟爱游戏app中的表达水平显着高于两个晚熟爱游戏app，这与之前的结果一致（图 S2）。上述结果进一步证明了数据的可靠性。 MElightcyan模块中的爱游戏app可能在调控爱游戏app从营养生长到生殖生长的转变中起重要作用。最值得注意的是，GH_D07G0876 的连接线（边）数量最多，它是 AtCAL 爱游戏app的同源爱游戏app，命名为 GhCAL（图 4c 和表 S4）。爱游戏appAtCAL过表达可促进早花。然而，除爱游戏app外，CAL 爱游戏app在其他爱游戏app中鲜有报道。

　　有趣的是，一些爱游戏app仅在两个早熟爱游戏app中在 5TLS 阶段表达（图 4a）。 这些爱游戏app来自ABCDE爱游戏app类。 ABCDE 爱游戏app是花发育中最广为人知和研究最充分的爱游戏app。 A类爱游戏app有4个AP1同源爱游戏app，B类包括3个PI同源爱游戏app，E类爱游戏app数量最多，即2个SEP2同源爱游戏app、4个SEP3爱游戏app和3个SEP4爱游戏app（图4b）。 这些爱游戏app仅在花器官中表达（图 S3）。

　　(a) ZM24 (WT)与Anti-GhCAL爱游戏app棉系的形态学比较。白色框是放大三倍的白色圆圈区域。

　　(d) 爱游戏app和野生型爱游戏app早熟相关性状的比较。DAS，播种后天数；BT，萌芽时间； FT，开花时机； NFFB，第一个果枝的节点； PH，株高； WGP，整个生长期。显示为平均加减标准偏差 (SD)；

　　为进一步证实GhCAL在爱游戏app中的功能作用，构建了含有由35s启动子驱动的GhCAL反义序列全长编码区的反义表达载体，并转化到ZM24（早熟爱游戏app爱游戏app）中。进一步研究了三个具有 GhCAL 沉默的 T3 爱游戏app爱游戏app品系，即Anti-GhCAL-1、Anti-GhCAL-2 和Anti-GhCAL3（图 5a）。使用特定引物的 qRT-PCR 分析证实 GhCAL 的转录水平显着低于WT爱游戏app（图 5b）。Anti-GhCAL 爱游戏app爱游戏app爱游戏app的花芽分化发生较晚（图 5c）。与WT相比，3个T3爱游戏app品系的出芽时间分别推迟了14、15和12天，开花时间分别推迟了19、21和14天。WT爱游戏app的第一个果枝通常出现在主茎的第 6 节或第 7 节，而爱游戏app爱游戏app则分别出现在第 11 节、第 12 节和第 10 节（图 5d）。在株高方面，三个爱游戏app爱游戏app品系显着短于野生型爱游戏app。上述结果表明，低GhCAL表达的延缓了爱游戏app从营养生长向生殖生长的转变。

　　为了探索 GhCAL 如何调节爱游戏app开花，分析了以 GhCAL 为中心的 WGCNA 爱游戏app网络中具有更多连接线（边缘）的其他爱游戏app的表达（图 4c）。编码AGL6同源基因的GH_D09G0468和编码AP1同源基因的GH_A04G1749分别命名为GhAGL6-D09和GhAP1-A04。 GhAGL6-D09 在子叶、芽尖、花芽和茎中表达。在芽尖中 GhAP1-A04 的表达最低，而在花蕾中观察到最高表达（图 S4）。在Anti-GhCAL 爱游戏app爱游戏app品系中，GhAGL6-D09 和 GhAP1-A04 的表达显著降低，这可能是由于 GhCAL 表达的降低（图 5e）。在 35S::GhCAL 爱游戏app爱游戏app株系中，与野生型爱游戏app相比，GhCAL 显着上调，而 AGL6 和 AP1 也分别显着上调近 220 倍和 2300 倍（图 S5b ）。这些结果表明，AGL6 和 AP1 受 GhCAL 调控，是控制从营养生长向生殖生长过渡的重要调节因子。

　　GhAGL6-D09 和 GhAP1-A04 的功能通过爱游戏app中的病毒诱导基因沉默 (VIGS) 进一步验证。 qRT-PCR显示VIGS爱游戏app具有较高的基因沉默效率，相应的沉默爱游戏app中GhAGL6-D09和GhAP-A04的表达显着降低（图6b，e）。与非VIGS（CK）爱游戏app相比，沉默爱游戏app的出芽和开花时间明显晚，第一个果枝的节数更高（图6a，c，d，f）。有趣的是，GhAGL6-D09 沉默的植株较短，这与Anti-GhCAL 爱游戏app爱游戏app品系的表型变化一致，GhAP1-A04 的表达显着降低，而 GhCAL 的表达稳定（图 6b）。然而，GhAP1-A04 沉默的爱游戏app更高，GhAGL6-D09 和 GhCAL 的表达水平与 CK 的表达水平没有显着差异（图 6e）。上述结果表明，GhAGL6-D09和GhAP1-A04在爱游戏app开花调控中起重要作用，GhAGL6-D09调控GhAP1-A04的表达。

　　(b) 蛋白质相互作用的酵母双杂交测定。 -Leu-Trp 缺失选择性培养基上的细胞生长代表正常细胞（上图），-Leu-Trp-His-Ade 缺失选择性培养基代表正相互作用（下图）。

　　GhCAL 介导的从营养生长到生殖生长过渡的调节途径。 正方形代表核酸，椭圆代表蛋白质。实线箭头表示本研究验证的调控关系，虚线箭头表示预测的调控关系

　　最后证明了MElightcyan、GhCAL模块中的Hub基因可以调节GhAGL6-D09和GhAP1-A04的表达，促进爱游戏app从营养生长向生殖生长的转变。我们提出了一个通过 GhCAL 诱导开花的工作流程（图 8）。在早熟爱游戏app中，GhCAL 以 3TLS 表达。 GhCAL与GhAGL6-D09形成异二聚体，可能与GhAGL6-D09启动子区的CArG-box结合爱游戏app官网，诱导GhAGL6-D09的表达，从而启动花芽分化。在 5TLS 时，GhCAL/GhAGL6 与 GhAP1-A04 形成异二聚体，可能与 GhAP1-A04 启动子区域的 CArG-box 结合并诱导 GhAP1-A04 的表达。 ABCDE模型中的GhAP1-A04和GhSEP4基因调控爱游戏app花器官的发育。在晚熟爱游戏app中，GhCAL 以 5TLS 表达，导致花芽分化开始较晚。一般来说，GhCAL作为整个通路的调节中心，调节从营养期到生殖期的过渡，以诱导早期开花。

　　石蜡切片的组织学分析结果表明，早熟爱游戏app的花芽分化发生在线TLS），晚熟爱游戏app的花芽分化发生在线TLS）。

　　在 MElightcyan 模块中鉴定了一个与花芽分化相关的新的关键调控基因 GhCAL。

　　Anti-GhCAL 爱游戏app棉花爱游戏app表现出晚花芽分化和开花时间。

　　本研究阐明了棉花开花调控的分子机制，为棉花早熟育种提供了良好的遗传资源。